在PCR過(guò)程中,可能會(huì)出現(xiàn)非特異性DNA的合成或引物二聚體的形成,導(dǎo)致PCR反應(yīng)的靈敏度和特異性不理想。此外,一般DNA聚合酶對(duì)于復(fù)雜的臨床樣本耐受性差,需要對(duì)核酸進(jìn)行純化后進(jìn)行擴(kuò)增。基于目前這些問(wèn)題,Medix Biochemica推出一種新型的Taq DNA聚合酶突變體,在室溫下穩(wěn)定,并且對(duì)于復(fù)雜的臨床樣本具有超強(qiáng)的耐受能力。
貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
Taq Hotstart DNA Polymerase |
400/4000 U |
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PlexTaq® 5x qPCR Multiplex Master Mix |
100/500 reactions |
為了獲得一種能在PCR反應(yīng)中具有更高特異性和靈敏度的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶,我們篩選了一個(gè)突變體,對(duì)DNA聚合酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,并對(duì)其突變進(jìn)一步設(shè)計(jì),使其僅在最佳PCR循環(huán)溫度下具有活性 (圖1)。
圖1. 突變位于熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶 α螺旋結(jié)構(gòu),
使酶在室溫下失活
為了進(jìn)一步改進(jìn)聚合酶的熱啟動(dòng)活性,設(shè)計(jì)一段用于結(jié)合酶活性位點(diǎn)的適配體,以熱可逆的方式激活/阻斷酶活性 (圖2)。低溫下當(dāng)適配體與酶緊密結(jié)合時(shí)阻斷酶活性,當(dāng)溫度高于55°C時(shí),適配體脫落,從而釋放酶活性。
圖2. 適配體修飾熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶
在PCR體系設(shè)置過(guò)程中,通常要求冰上或低溫環(huán)境下操作。對(duì)于新型的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶,可以允許其在常溫條件下操作,簡(jiǎn)化了PCR試劑配置的流程。
將新型的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶和野生型Taq DNA聚合酶進(jìn)行對(duì)比。DNA模板濃度由1-0.001 ng/μL梯度稀釋后,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并且兩種酶同時(shí)于21°C條件下孵育6h后再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。新型的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶特異性表現(xiàn)良好,并且在21°C條件下孵育后,酶活性保持不變 (圖3)。
圖3. 新型熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶和
野生型Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增對(duì)比
經(jīng)特別設(shè)計(jì)的新型熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶不需要特別的激活步驟,可快速啟動(dòng)PCR擴(kuò)增,使PCR整體反應(yīng)時(shí)間減少。用于多重病原體擴(kuò)增,設(shè)置不同的DNA模板濃度10000-10拷貝/反應(yīng) (內(nèi)參基因濃度5000拷貝/反應(yīng)),實(shí)驗(yàn)證明新型熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶在相同擴(kuò)增條件下可以更快得到可靠的多重檢測(cè)結(jié)果 (圖4)。
PlexTaq已經(jīng)成功用于基于NGS方法進(jìn)行30+重HLA分型檢測(cè)和基于tNGS對(duì)于植物葉片進(jìn)行30+個(gè)靶點(diǎn)檢測(cè)。


圖4. 新型熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶于多重病原體檢測(cè)的應(yīng)用
圖5. 新型熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶于血液樣本檢測(cè)的表現(xiàn)
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